1.
Definisi
Keberadaan inokulasi ini sangat membantu
manusia untuk memenuhi kebutuhan akan mikroba diberbagai bidang. Baik dalam
bidang pertanian, pangan, kesehatan dan sebagainya. Khususnya dalam bidang
pangan, inokulasi sangat membantu untuk mendapatkan spesies mikroba yang
digunakan dalam menciptkan produk baru dan pengawetan bahan pangan. Tidak hanya
itu, proses inokulasijuga membantu para peneliti untuk mengidentifikasi mikroba
yang dapat meruusak bahan pangan. Proses inokulasi harus dilakukan di tempat
yang benar-benar steril agar media tidak terkontaminasi oleh mikroba lain yang
bukan menjadi mikroba target.
Inokulasi
didefinisiskan sebagai pemindahan
mikroba dari medium sumber ke medium baru baik itu meda berbentuk cair
maupun media yang berbentuk padat. Tujuan dilakukannya inokulasi iyalah untuk
memperbanyak mikroba yang didaptkan dari medium sumber dan untuk mengetahui
variasi mikroba yang terdapat dalam satu medium tertentu.peredaan mendasar
antara inokulasi dan isolasi adalah pada inokuulasi, kita baru mencari tahu apa
saja mikroba yangterkandung dalam suatu bahan alami sehingga dalam satu cawan
petri terdapat lebih dari satu jenis mikroba. Sedangkan pada isolasi, mikroba
yang dikultivasi merupakan biakan murni yang berarti bahwa mikroba tersebut
berasal dari satu jenis sel tunggal. Dalam melakukan melakukan inokulasi,
digunakan medium yang telah dibuat sebelumnya. Dimana, dalam medium ini
terkandung nutrisi yang dibutuhkan mikroba untuk hidup. Adapun beberapa
nutrient penting yang dibutuhkan oleh mikroba iyalah karbohidrat, protein,
fosfat, nitrogen dan sebagainya.
Pada medium yang telah
berisi mikroorganisme, lambat laun akan menunjukkan tanda-tanda mikroba yang
tumbuh. Dari beberapa jenis media yang digunakan dapat diketahui jenis mikroba
yang akan tumbuh. Hal ini karena beberapa medium selektif untuk mikroba
tertentu. Namun ada pula medium yang menumbuhkan segala jenis mikroba seperti Plate Count Agar (PCA). Khusus media Plate Count Agar (PCA), jenis mikroba
dapat dikteahui setelah adanya kenampakan berupa bentuk, warna, berkoloni atau
soliter, berserabut, dan berbagai ciri lainnya.
2.
Metode
Cawan Sebar (Spread Plate)
Metode spread plate
(cawan sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam
media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri di atas media agar yang
telah memadat. Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat
tersebar merata pada bagian permukaan media agar. Pada metode cawan sebar
sebanyak 0,1 mL suspensi bakteri yang telah diencerkan (disebar pada media
penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan
diratakan dengan batang pengaduk yang dibengkokkan agar koloni tumbuh merata pada media dalam
cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam inkubator (37oC) selama
1-3 hari .Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan batang
drugal, untuk menumbuhkan koloni secara merata, biakan justru terkontaminasi
Metode ini memungkinkan tumbuhnya mikroba jenis aerob
karena adanya ruang bagi oksigen dalam cawan petri.
Media dituang hingga memenuhi 2/3 bagian
dari cawan petri lalu tunggu hingga dingin dan mengeras. Setelah itu sebanyak 1
ml suspensi hasil pengenceran 10-4 dipindahkan ke dalam cawan petri.
Selanjutnya, mikroba tersebut disebar secara merata pada media menggunakan hockey stick lalu di inkubasi selama
kurang lebih 6 x 24 jam.
 |
| Perbedaan Metode Cawan Sebar dan Metode Cawan Tuang |
3.
Metode
Cawan Tuang (Pour Plate)
Metode ini memerlukan pengenceran
sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri. Setelah diinkubasi
akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung.
Metode pour plate sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan
khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan
mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 mL garam
fisiologis atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH
agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat
dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau
memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Penuangan
dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjadi kontaminasi
atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan (di laboratorium,
kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam
biakan). Metode ini memungkinkan tumbuhnya mikroba jenis anaerob. Hal ini
disebabkan tidak adanya ruang bagi oksigen untuk mikroba. Mikroba yang tumbuh
tidak mendapat suplai oksigen karena setelah proses penuangan mikroba media
kembali dituangkan keatas mikroba sehingga semua permukaan mikroba tertutupi
oleh media.
Untuk melakukan
inokulasi metode spread plate, berikut disajikan prosedurnya:
Tuang media sebanyak 1/5 volume cawan petri ke dalam
cawan Petri. Selanjutnya, tunggu didingankan hingga media mengeras. Setelah
media mengeras, suspense mikroba hasil pengenceran 10-4 dipindahkan
dari tabung rekasi sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri. Berikutnya, media
dituang kembali hingga memenuhi ¼ volume cawan Petri. Terakhir, dinginkan
dilanjutkan dengan inkubasi.
4.
Larutan
Fisiologis
Berikutnya
adalah larutan fisiologis. Kenapa harus membahas tentang larutan fisiologis? Yah,
karena larutan ini banyak digunakan dalam proses inokulasi. Larutan fisiologis
digunakan untuk melarutkan dan mengencerkan mikroba dalam pengenceran
bertingkat. Larutan fisologi digunakan untuk menjaga tekanan osmotic sel
sehingga selnya tidak pecah. Larutan garam fisiologi merupakan larutan
isotonis yang memiliki banyak kegunaan dalam bidang medis dan laboratorium,
dan umumnya larutan garam fisiologi memiliki kisaran konsentrasi 0.9%
(b/v) NaCl.
NaCl fisologis digunakan sebagai pengencer agar suspense sampel tetap steril
dan menghindari adanya kontaminan pada sampel.
Mungkin ada yang
bertanya, kok bisa larutan fisiologis dapat menjaga tekanan osmotic pada sel?
Begini, tekanan osmotic timbul karena adanya perbedaan konsentrasi antara
molekul larutan dengan molekul pelarutnya. Nah, larutan fisiologis sendiri
merupaka larutan yang berasal dari campuran NaOH dan HCl yang akan menghasilkan
senyawa NaCl dan H2O. NaCl merupakan senyawa dengan ikatan ionik yang berarti
senyawa ini mengandung atom-atom yang stabil sehingga tidak akan mempengaruhi
meolekul-molekul dalam sel mikroba.
Untuk
membuat larutan fisiologis, dapat dilakukan dengan menyiapkan larutan NaCl
sebanyak 6,379 gram kemudian ditambahkan akuades sebanyak 750 ml dan dimasukkan
ke dalam erlenmeyer. Setelah itu, dihomogenkan lalu dilakukan sterilisasi
menggunakan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121oC pada tekanan
1 atm.
5.
Pengenceran
Bertingkat
Proses yang dilakukan
sebelum inokulasi adalah mikroba yang sudah di cairkan harus melewati tahap
pengenceran bertingkat terlebih dahulu. Hal ini bertujuan untuk mengurangi
jumlah mikroba yang tersuspensi agar pada petumbuhannya nanti mikroba yang
tumbuh dapat dihitung dan koloni yang terbentuk tidak terlalu tebal. Koloni
yang telau tebal akan menghasilkan biakan yang sulit dihitung. untuk itu
digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan
selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel
mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Pengenceran sangat
penting dilakukan karena jumlah mikroba dapat mempengaruhi prses
perhitungannya. Apabila pengenceran terlalu tinggi, maka kemungkinan jumlah
mikroba yang tersuspensi sangat sedikit sehingga menghasilkan biakan dengan
jumlah yang sangat sedikit. Sedangkan apabila tingkat pengenceran bertingkat
terlalu rendah, mikroba yang tersuspensi masih terlalu banyak sehingga
menghasilkan koloni biakan yang terlalu tebal. Koloni yang terlalu tebal
menyulitkan pengamat untuk mengamati cirri morfologi yang mikroba yang tumbuh. Hal
ini pun dapat menyulitkan untuk menentukan jenis mikroba yang diionuklasikan.
 |
| Pengaruh Faktor Pengenceran Bertingkat |
Berikut adalah Prosedur pengenceran bertingkat :
 |
| Langkah-langkah Pengenceran Bertingkat |
Semua
bahan alami sperti berupa pisang, mangga, dan tempe masing masing diambil
bagian yang mengandung mikroba sebanyak 1 gram kemudian diencerkan dengan 10 ml
larutan fisiologis. Khsus untuk bahan tape dan tomat, masing masing diambil
ekstraknya berupa cairan sebanyak 1 ml. Selanjutnya, masing-masing mikroba yang
tersuspensi dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain
yang telah diisi dengan 9 ml larutan fisiologi kemudian dihomogenkan. Hasil
pengenceran inilah disebut dengan faktor pengenceran 10-1.
Selanjutnya, dari tabung hasil pengenceran 10-1, mikroba yang
tersuspensi dipipet lagi 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain yang
telah berisi 9 ml larutan fisiologis dan menghasilkan pengenceran 10-2. Selanjutnya dilakukan hal serupa sebanyak dua
kali lagi untuk pengenceran 10-4.
Terdapar perbedaan mendasar pada pengenceran bertingkat bahan cair dan bahan padat. Apabila kita menggunakan suspensi mikroba dalam bentuk cair maka tingkat pengenceran pada tabung pertama adalah 10-1 Sedangkan apabila kita menggunakan suspense mikroba
dari bahan padat, maka suspense ini harus dicairkan terlebih dahulu dengan
menimbang suspense padatan sebanyak 1ml lalu ditambahkan 10 ml larutan
fisiologis barulah kemudian dihomogenkan. Seteah itu barulah dipipet 1 ml dari
seuspensi yang sudah dicairkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang
berisi 9ml larutan fisiolgis dan barulah tingkat pengencerannya 10-1.
6.
Inkubasi
Setelah melewati
beberapa proses seperti pengenceran bertingkat bahkan hingga proses inokulasi
melalui metode cawan sebar dan cawan tuang, berikutnya adalah proses inkubasi. Proses
ini merupakan proses dimana mikroba yang siap dikultivasi akan dipindahkan ke
dalam incubator. Artinya, pada tahap inilah mikroba mulai mengalami
pertumbuhan. Mengapa harus dalam incubator? Karena incubator mampu
mempertahankan suhunya pada suhu optimum sebagian besar mikroba yakni, 37 – 40OC.
Pada rentan suhu ini beberapa jenis mikroba dapat tumbuh dengan optimal. Proses inkubasi juga dilakukan untuk mengamati
pertumbuhan mikroba setiap fasenya. Berikut adalahh fase pertumbuhan mikroba
Fase
lag (Penyesuaian/Adaptasi)
Fase ini belum
menunjukkan pertumbuhan mikroba secara signifikan. Pada fase ini mikroba
menyesuaikan diri dengan lingkungan barunya. Hal inilah mengapa jika dilihat
pada kurva pertumbuhan mikroba, bentuknya mendatar.
Fase
Eksponensial/Logaritmik
Fase ini merupakan fase
dimana mikroba telah beradaptasi dengan lingkungannya dan mulai memafaatkan
nutrisi yang ada di lingkungannya. Proses perkembangbiakan mikroba sudah
terjadi. Dengan kata lain mikroba sudah memulai aktifitas memperbanyak diri
sehingga beberapa koloni dapt terlihat. Hal
inilah yang membuat kurva pada fase ini meningkat secara signifikan.
Fase
Pengurangan Pertumbuhan
Fase ini, mikroba
tetaptumbuh, namun pertambahan individunya berkurang. Artinya, mikroba tetap
berkembang biak, namun jumlah sel anakannya mulai berkurang. Hal in dikarenakan
factor nutrient yang sudah mulai berkurang. kepada mempertahankan diri karena
persediaan nutrisi sudah mulai berkurang. Pada fase ini, mikroba tidak lagi
dapat memperbanyak diri melainkan hanya memanfaatkan nutrisi yang ada untuk
bertahan hidup.
Fase
Stasioner
Fase ini lebih kepada
fase mikroba mempertahankan diri. Pada fase ini, tidak adalagi proses
penambahan jumlah mikroba dikarena nutrisi yang ada hanya cukup untuk
mempertahankan hidup mikroba tersebut. Maka dari itu, kurava pada fase ini
hanya mendatar karena tidak adanya pertambahan jumlah mikroba dan mikroba belum
mengalami kematian.
Fase
Kematian
Sesuai dengan namanya,
fase ini merupakan fase dimana mikroba telah kehabisan nutrisi untuk tumbuh. Biasanya,
jika mikroba telah mencapai fase ini, media akan berubah warna menjadi putih
bening. Itu tandanya nutrient dalam media tersebut dufah habis sehingga mikroba
mengalami kematian.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar