STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

1.    Apa Itu Sterilisasi ?

Sterilisasi adalah proses  mematikan atau meniadakan segala jenis mikroba selain mikroba target. Sterilisasi harus dapat menghilangkan mikroba hingga bagian yang resisten sekalipun atau biasa disebut dengan spora.

Alat yang sudah distrelisisasi mungkin saja masih terdapat mikroba namun tidak dapat lagi berkembang biak pada suhu normal. Perlakuan fisik yang diberikan untuk melakukan sterilisasi berupa pemanasan kering, uap air panas dan penyaringan

Sterilisasi dibagi menjadi tiga jenis yatu, sterilisasi fisik, sterilisasi kimiawi dan sterilisasi mekanik. Mari kita bahas satu persatu

·           Sterilisasi Fisik

Gambar Autoklaf

Sterilisasi Fisik dibedakan menjadi dua jenis yaitu pemanasan dan penyinaran. Pemanasan dapat dilakukan melalui proses pemijaran, uap air panas dan panas kering. Pemijaran dilakukan dengan memijarkan alat secara langsung pada api. Panas kering dilakukan dengan memanfaatkan oven pada suhu yang sangat tinggi (160-180^oC). sterilisasi panas kering cocok untuk alat-alat yang terbuat dari kaca. Sterilisasi uap air panas umumnya memanfaatkan alat yang disebut autoklaf. Alat ini akan memanaskan air kemudian uapnya dimanfaatkan untuk mematikan mikroba. Autoklaf bekerja pada tekanan 1 atm dengan suhu 121^OC selama kurang lebih 15 menit.

·           Sterilisasi Kimia

Sterilisasi kimia merupakan proses sterilisasi dengan memanfaatkan bahan-bahan kimia untuk dapat mematikan mikroba. Sterilisasi kimiawi umumnya menggunakan alkohol 70%, etilen oksida dan gas tertentu.

·           Sterilisasi Mekanik

Sterilisasi mekanik merupakan sterilisasi  melalui saringan (filtrasi). Metode ini memanfaatkan alat berupa saringan dengan ukuran pori minimal 0.2 - 0.4 mikronmeter yang dibuat dari berbagai macam bahan septi selulosa asetat, selulosa nitrat, polimer akrilik, polyester danberbagai bahan yang termasuk memban logam lainnya. Metode ini tidak mematikan mikroba melainkan hanya menyaring suspense dimana yang tertinggal pada saringan adalah mikrobanya. Prinsip kerjanya sama seperti menyaring liquid dari suspensi besarnya. Artinya, metode ini dapat dilakukan untuk mengurangi mikroba yang dilakukan khusus untuk bahan-bahan yang tidak tahan panas ataupun tidak dapat tersentuh bahan kimiatertentu.  Proses seterilisasi mekanik harus dibarengi dengan tingkat aseptik yang tinggi terutama pada alat penyaring yang digunakan.

2.    Perbedaannya dengan Pasteurisasi?

Proses Pasteurisasi merupakan proses mengurangi mikroba dalam arti, proses ini tidak menghilangkan mikroba 100%. Berbeda dengan sterilisasi yang memang menghilangkan mikroba 100%. Proses pasteurisasi hanya bekerja hingga suhu 105^OC dalam tekanan normal memanfaatkan uap panas. Alat yang digunakan pun masih tergolong alat sederhana. Waktu yang digunakan untuk proses ini tergantung kuantitas bahan yang akan dipasteurisasi dan meemakan waktu berjam-jam untuk menyelesaikan prosesnya.

3.    Bagaimana Mekanisme  Alkohol Dalam Mematikan Mikroba?

Alkohol mematikan mikroba melalui dua cara yakni, melalui denaturasi protein dan pelarutan lemak. Denaturasi protein merupakan fase rusaknya protein di dalam sel karena kekurangan ataupun kelebihan air sehingga aktifitas metabolisme dalam sel menjadi terhambat. Proses denaturasi ini terjadi ketika alkohol masuk  dan bereaski dengan cairan yang ada di dalam sel. Alkohol mengandung gugus -OH yang bersifat hidrofilik sehingga dapat menimbulkan interaksi  yang sangat kuat apabila bertemu dengan air. Akibatnya, kelarutan protein dalam sel akan berkurang dan aktifitasnya terhambat. Ketika konsentrasi air di luar sel lebih banyak, maka air di dalam sel akan cenderung masuk ke dalam sel kemudian terus mengisi ruang sel dan mengakibatkan sel mengalami kelebihan air dan kemudia pecah (lisis). Namun, apabila konsentrasi cairan di dalam sel lebih tinggi lebih dari konsentrasi cairan di luar sel, maka cairan dalam sel akan cenderung meninggalkan sel dan sel akan mengalami dehidrasi (kekurangan air) dan kemudian mengkerut. Proses inilah yang disebut krenasi.

Selanjutnya, proses mematikan mikroba melalui pelarutan lipid. Mekanisme ini terjadi khusus pada bakteri dimana dinding selnya tersusun atas lemak. Lemak ini sendiri menjadi pertahanan diri bagi sel mikroba. Selain mengandung gugs –OH, alkohl juga terdiri atas gugus alkil yaitu CH3CH2- yang dapat berikatan dengan lemak karena sifatnya yang hidrofobik sama seperti sifat lemak. Lemak yang larut dalam alkohol kemudian akan merusak pertahanan sel dan kemudian merusak dinding selnya. Hal ini akan mempengaruhi kinerja berbagai organel dalam sel bakteri.

4.    Bagaimana Cara Sterilisasi Dengan Autoklaf?

Salah satu alat yang umum digunakan dalam sterilisasi kering adalah autoklaf. Autoklaf merupakan instrumen yang digunakan untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi. Autoklaf mematikan mikroba melalui uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya sekitar 1 atm dan dengan suhu 121^oC (250^oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh per-mukaan benda adalah 15 pon tiap inchi. Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121^oC.

5.    Kenapa Harus Alkohol 70%?

Alkohol 70% mengandung 70% etanol dan 30% air. Perbandingan konsentrasi ini dianggap mampu mempengaruhi konsentrasi air dalam sel mikroba. Adanya konsentrasi air yang sesuai, dapat mengakibatkan sel mengalami lisis ataupun krenasi. Apabila konsentrasi alkohol terlalu tinggi, maka proses denaturasi protein bisa saja tidak dapat berlangsung dan yang ada hanya pelarutan lemaknya saja. Hal ini berarti konsentrasi yang tinggi hanya merusak bagian dinding sel bakteri. Sedangkan, apabila konsentrasinya terlalu rendah maka, lipidnya tidak larut secara menyeluruh sehingga dinding selnya sulit untuk dirusak.

6.    Apa Itu Media?

Media merupakan suatu bahan yang komposisi utamanya adalah agar dan berfungsi sebagai tempat tumbuhnya mikroba karena mengandung nutrisi. Ketepatan komposisi medium tergantung pada kebutuhan spesies yang akan dikul-tivasi karena kebutuhan nutrisi sangat bervariasi. 

Media dibedakan menjadi beberapa jenis yaitu media sintesis, media semi sintesis, dan media alami. Media sintesis adalah media yang sudah dalam bentuk serbuk siap pakai sehingga penggunaannya lebih mudah karena cukup dicampurkan dengan akuades lalu dihomogenkan. Contoh media sintesis antara lain Potato Dextrose Agar (PDA), Plate Count Agar (PCA), Yeast Extract Agar (YEA), Nutrient Agar (NA) dan lain-lain. Media semi sintesis merupakan media yang dibuat dari bahan alami seperti kentang, tauge, wortel, dan media alami lainnya yang dicampur dengan gula, agar, dan akuades. Contoh media semi sintesis antara lain kentan agar, tauge agar, dan lain-lain. Media alami dapat berupa tanah, telapak tangan, usus makhluk hidup, dan sebagainya.

7.    Potato Dextrose Agar (PDA)

Potato Dextrose Agar (PDA) adalah media semi sintesis yang berbahan dasar ekstrak kentang. Media ini mengandung dekstros yaitu gula golongan monosakarida sebagai nutrisi utama bagi pertumbuhan kapang. Potato Dextrose Agar (PDA) dapat menyesuaikan pH menjadi 3,5 oleh asam tartarik sehingga dapat mencegah mikroba lain dapat tumbuh.  Potato Dextrose Agar (PDA) berfungsi sebagai media yang sangat baik untuk menumbuhkan mikroba jenis kapang. Namun tidak menutup kemungkinan khamir pun dapat tumbuh. Selain itu PDA juga berfungsi mempertahankan persediaan biakan dermatofit tertentu. Potato Dextrose Agar   (PDA) terbuat dari ekstrak kentang, agar-agar, gula, dan akuades.

Cara pembuatannya yaitu dengan menyiapkan Serbuk Potato Dextrose Agar (PDA) 10 gr kemudian dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan air sebanyak 250 ml. Selanjutnya, suspensi dihomogenkan dan dipanaskan di dalam microwave. Setelah itu didinginkan beberapa saat ldan ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Terakhir dilakukan sterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121^oC, tekanan 1 atm selama 15 menit.

8.    Plate Count Agar (PCA)

Plate Count Agar (PCA) adalah media semi sintesis yang mengandung enzim kasein hidrolisat yang di dalamnya menyediakan asam amino dan zat nitrogen kompleks lainnya. Disamping itu juga mengandung ekstrak ragi sebagai persediaan vitamin B. Media Plate Count Agar (PCA) ini berfungsi sebagai media untuk membiakkan semua jenis mikroba. Komposisi dari media Plate Count Agar (PCA)adalah tripton, ekstrak ragi, agar-agar dan gluko-sa. Kebanyakan peneliti lebih suka menggunakan media Plate Count Agar (PCA) untuk inokulasi permukaan di cawan petri karena dapat menghasilkan mikroba yang lebih banyak.

Cara pembuatannya adalah dengan menyiapkan serbuk Plate Count Agar (PCA) 5,25 gr.  Serbuk media tersebut dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan air sebanyak 250 ml. Selanjutnya, masing-masing suspensi dihomogenkan dan dipanaskan di dalam microwave. Setelah itu didinginkan beberapa saat lalu ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Terakhir dilakukan sterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121^oC, teka-nan 1 atm selama 15 menit.

9.    Nutrient Agar (NA)

Nutrient Agar (NA) adalah media yang paling dasar yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba jenis mikroba berupa bakteri. Hal ini dikarenakan Nutrient Agar  mengandung unsur utama berupa protein yang menjadi sumber nut-risi utama bagi pertumbuhan bakteri. Sumber protein ini diperoleh dri ekstrak daging. Beef extract atau ekstrak daging sapi mengandung senyawa-senyawa yang larut di dalam air termasuk karbohidrat, vitamin, nitrogen organik dan juga ga-ram. Pepton merupakan sumber utama dari nitrogen organik, yang merupakan asam amino dan peptida rantai panjang. Komposisi Nutrient Agar (NA) terdiri atas  ekstrak daging, pepton, agar, dan akuades.

Media ini dapat dibuat dengan cara menyiapkan serbuk Nutrient Agar (NA) 5 gr di-siapkan lalu masing-masing serbuk media tersebut dimasukkan ke dalam labu erlen-meyer kemudian ditambahkan air masing -masing sebanyak 250 ml. Selanjutnya, masing-masing suspensi dihomogenkan dan dipanaskan di dalam microwave. Setelah itu didinginkan beberapa saat ldan ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Terakhir dilakukan sterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121^oC, teka-nan 1 atm selama 15 menit.

10.    Kentang Agar

Kentang agar merupakan media sintesis yang berbahan dasar kentang. Kentang agr berfungsi sebagai media untuk menumbuhkan kapang. Kandungan gula di dalamnya dapat menjadi nutrisi utama bagi pertumbuhan kapang. Selain dapt menumbuhkan kapang, juga dapat menjadi media untuk menumbuhkan khamir namun pertumbuhan optimal terjadi pada kapang. Komposisinya terdiri atas ekstrak kentang, agar dan gula. Penambahan agar dimaksudkan sebagai pemadat media. Lalu, apa bedanya dengan media PDA? Nah, perebdaannya tereletak pada kandungan gulanya. Pada PDA gula yang terkandung sudah dalam bentuk dekstrose yang merupakan gula jenis monosakarida sedangkan pada kentang agar masih dalam bentuk pati atau gula kompleks.

Cara pembuatannya adalah menyiapkan dua buah kentang dengan bobot kurang lebih 100 gram. Kentang dicuci lalu dikupas dan dihaluskan dengan menggunkan blender. Selanjutnya, kentang yang sudah dihaluskan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan akuades sebanyak 233 ml. Kemudian, dipanaskan sekaligus dihomogenkan di dalam microwave. Setelah itu kentang disaring untuk diambil ekstraknya kemudian ditambahkan agar sebanyak 4 gram, gula sebanyak 17 gram. suspensi kembali dihomogenkan dan dipanaskan di dalam microwave untuk mendapatkan media yang bening. Setelah suspensi mendidih dan cairannya berubah menjadi lebih jernih kemudian dinginkan beberapa saat. Setelah itu, labu erlenmeyer yang berisi media ini ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Terakhir, dilakukan sterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit degan suhu 121^oC pada tekanan 1 atm.

11.    Tauge Agar

Tauge Agar termasuk dalam media semi sintesis karena tersusun dari bahan alami berupa tauge dan bahan sintesis yaitu sukrosa dan agar. Tauge agar menyediakan nitrogen sebagai salah satu nutrisi yang dibutuhkan mikroorganisme. Karobihidraat didapatkan dari campuran gula pada saat proses pem-buatannya. Media tauge agar digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme jenis khamir dan kapang.

Cara pembuatannya dengan menyiapkan 300 gram tauge. Tauge dipisahkan dari akarnya lalu dicuci dengan air bersih kemudian dihancurkan hingga halus dan dimasuk-kan ke dalam labu erlenmeyer. Berikutnya, ditambahkan akuades sebanyak
250ml lalu dihomogenkan sekaligus dipa-naskan dalam microwave. Selanjutnya, saring tauge untuk mengambil ekstraknya lalu ditambahkan agar dan sukrosa. Sus-pensi kembali dihomogenkan dan dipa-naskan dalam microwave hingga mendi-dih dan tampak jernih. Setelah itu, didinginkan dan ditutup menggunakan kapas dan alumunium foil. Terakhir dila-kukan proses sterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121^oC pada tekanan 1 atm.

DAFTAR PUSTAKA

Anisah. 2010. Media Alternatif untuk Pertumbuhan Bakteri. Benjamin Cummings Publihing Company, Inc, California, USA.

Cahyani, Vita Ratri. 2009. Pengaruh Beberapa Metode Sterilisasi Tanah Terhadap Status Hara, Populasi Mikrobiota, Potensi Infeksi Mikorisa, Dan Pertumbuhan Tanaman. Universitas Sebelas Mret. Solo

Maulana, Urief. 2014. Penggunaan potato Dextrose Agar (PDA). Universitas Gunadarma. Yogyakarta.

Rakhmawati, Anna. 2012. Penyiapan Media Mikroorganisme. Universi-tas Negeri Yogyakarta.

Sugianto. 2012. Mikrobiologi Farmasi. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.

Sunaryo, T. 2007. Pengelolaan Sumber Daya Air Konsep Dan Penerapannya. Bayumedya Publishing. Malang