IDENTIFIKASI MIKROBA METODE PEWARNAAN GRAM

Proses mengidentifikasi mikroba metode pewarnaan gram melewati beberapa tahap antara lain fiksasi dan penuangan larutan Kristal violet, larutan iodine, larutan alkohol, larutan safranin, dan larutan akuades. Larutan Kristal violet berfungsi memberi warna ungu pada bakteri gram positif, iodine berfungsi memperkuat warna primer pada bakteri gram positif, larutan alkohol berfungsi  memucatkan atau melunturkan warna primer pada bakteri gram negative, larutan safranin berfungsi memberi warna merah pada bakteri gram negative, dan larutan akuades berfungsi membilas bakteri ketika sudah ditetesi larutan-larutan diatas.

Lactobacillus casei

Lactobacillus casei adalah bakteri yang digolongkan dalam probiotik termasuk bakteri Gram-positif, anaerob, tidak memiliki alat gerak, tidak menghasilkan spora, berbentuk batang dan menjadi salah satu bakteri yang berperan penting. Bakteri ini berukuran 0,7 – 1,1 x 2,0 – 4,0 µm. Lactobacillus adalah bakteri yang bisa memecah protein, karbohidrat, dan lemak dalam makanan, dan membantu penyerapan elemen penting dan nutrisi seperti mineral, asam amino, dan vitamin yang dibutuhkan manusia dan hewan untuk bertahan hidup Hal ini sesuai dengan pendapat Cahyanti (2011) yang menyatakan L. casei digolongkan ke dalam probiotik karena dapat meningkatkan kesehatan yang mengkonsumsinya

Bakteri Gram Positif dan Negatif

Bakteri terbagi atas bakteri Gram positif dan bakteri Gram negative. Bakteri Gram positif dinding selnya mengandung peptidoglikan dan juga asam teikoat dan asam teikuronat. Oleh sebab itu dinding sel bakteri Gram positif sebagian adalah polisakarida. Pada beberapa bakteri asam teikoat merupakan antigen permukaan (antigen dinding sel), dan ada yang merupakan selaput pada selnya. Pada pewarnaan Gram bakteri Gram positif berwarna ungu. Bakteri Gram negatif merupakan bakteri yang dindinng selnya dapat menyerap warna merah. Bakteri ini memiliki lapisan peptidogligan yang tipis yang terdapat pada ruang periplasmik yaitu antara membrane luar dan membrane plasma.

Metode Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram dilakukan dengan beberapa metode seperti metode pewarnaan diferensial, pewarnaan sederhana. Metode pewarnaan diferensial adalah mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Metode pewarnaan difensial dibagi atas pewarnaan Gram, dan pewarnaan tahan asam. Metode pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni Gram positif dan Gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Sedangkan metode tahan asam pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol.

Fiksasi

Fiksasi adalah proses pelekatan dan penempelan struktur sel mikroor-ganisme pada suatu posisi. Fiksasi dilakukan setelah pengolesan mikroba pada kaca preparat. Olesan yang belum kering akan mengakibatkan sel-sel mikroba menjadi tidak beraturan bentuknya. Fiksasi yang terlalu lama akan menimbulkan kematian sel pada bakteri sehingga selnya sulit dilihat di mikroskop. Tujuan dari fiksasi adalah agar mikroba dapat melekat dengan baik dan tidak mudah larut saat proses pembilasan dengan akuades.

Kristal Violet

Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) memiliki komposisi Kristal violet 2 gram, Alkohol 95% sebanyak 20 ml,  Aquadest 80 ml, dan Amonium oksalat    sebanyak 0,8 gram. Cara pembuatannya dimulai dengan persiapan alat dan bahan. Selanjutnya, Kristal violet dicampur dengan ammonium oksalat dan dihaluskan dengan stampler kemudian ditambahkan akuadesdan alkohol. Bahan yang tercampur diaduk rata dan dimasukkan ke dalam botol. Pewarna Kristal violet memberi warna ungu pada mikroorganisme yang diinginkan dan berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada membran sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid-crystal violet.

Safranin

Safranin digunakan sebagai pewarna sekunder dalam beberapa pewarnaan preparat dan memberikan warna merah pada preparat. Komposisi dalam safranin adalah Safranin sebanyak 0,25 gram,  Alkohol 95%  sebanyak 10 ml, dan Aquadest sebanyak 90 ml. cara pembuatannya dimulai dengan penyiapan alat dan bahan. Selanjutnya, semua bahan ditimbang sesuai takaran dan dicampur lalu dihaluskan dan dimasukkan ke dalam botol.

Safranin juga memiliki kelemahan diantaranya adalah pada preparat tertentu  warnanya sulit terserap. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol..

Alkohol

Alkohol merupakan denaturan protein, suatu sifat yang terutama memberikan aktivitas  antimikrobial pada alkohol. Alkohol mengandung etanol dan diencerkan hingga konsentrasi 70% menggunakan akuades. Alkohol dalam proses pewarnaan gram digunakan untuk untuk melunturkan atau memucatkan warna primer. Hal ini terjadi pada bakteri gram positif yang mengandung banyak lemak sehingga lapisan dinding selnya larut bersama alkohol danmengakibatkan lunturnya warna primer.

Aquades

Akuades digunakan sebagai laru-tan untuk membilas bakteri setelah ditetesi larutan Kristal violet, iodin, alkohol, dan larutan safranin.

Iodin

Iodin adalah salah satu larutan yang digunakan pada metode pewarnaan gram. Iodin berfungsi untuk memperkuat warna primer pada dinding sel mikroba gram positif. Komposisi iodine terdiri atas iodium, kalium iodide, alkohol dan akuades. Proses pembuatan iodine diawalai dengan iodium dicampur dengan kalium iodide dan alkohol. Lalu diencerkan dengan akuades. Ketika iodin diaplikasikan maka larutan Kristal violet yang telah diberikan sebelumnya akan sulit melewati dinding sel.